Professor Layton erhält von einer seiner ehemaligen Studentinnen, der Opernsängerin Jenis Quatlane, einen Brief. Er enthält Operntickets und einen Bericht, in dem Jenis erzählt, dass eine Freundin von ihr ein Jahr zuvor verstorben und nun in Gestalt eines siebenjährigen Mädchens wieder aufgetaucht sei. Das Mädchen behauptet: „Ich habe ein unsterbliches Leben erlangt.“Um diesem Rätsel auf den Grund zu gehen, machen sich Professor Layton, Luke und Laytons Assistentin Remi auf die Reise, um die Oper im „Crown Petone Theater“ zu sehen. Die Oper, eine neue Komposition des Pianisten Oslo Whistler, beruht auf Forschungsarbeiten des Mentors von Professor Layton, Dr. Schraeder, und behandelt die Legende des uralten Königreiches Ambrosia, dem Land des ewigen Lebens …